先如今阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据,也是确定代测样本中是否存在代测蛋白的一个依据!尤其是检测的样本是不确定是否有代测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时,的选择是实验合适的阳性对照。说明书上都有推荐的阳性对照。但是如果说明书上没有推荐时,请参考以下条款:
一、看看说明书中是否有Abreviews。任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照!
二、根据说明书上的Swiss-Prot或Omnigene数据库来查找。这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织,这也可以作为合适的阳性对照!
三、查找该蛋白的GeneCards,这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。
一般来说,抗体说明书都会提供一个稀释度范围,但是,有些公司生产的抗体,其说明书上没有提供抗体稀释度。这是可以理解的,因为如果说明书上标明的抗体稀释度如果高的话,就说明这种抗体效价不高,质量不好。为此,实验者可以先在网上搜索一些相关的文献,文献的方法与材料中一般会把抗体来源以及稀释度都详细的标出的。但真正做实验时,还是要根据自己实验样品的情况和检测指标表达的丰富程度等因素先摸索一下抗体的稀释度的。
所以在做预实验时,就采用倍比稀释法,先做一个梯度,比如1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600. 看看在这几个梯度范围内,样品中的目的蛋白的表达情况,然后再从中确定你认为理想的稀释度进行正式实验,这样做比较好一些。由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响,推荐浓度仅作为参考。